滨松中国成像大赛

往届参赛作品

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单分子蛋白TIRF-FRET双色同步成像

参赛者信息:王振才

所用相机:Flash 4.0 (C11440-22CU) & W-View GEMINI双色分光器

成像方法:单分子TIRF-FRET双色同步成像

显微镜物镜:Apo TIRF 100x Oil NA1.49

拍摄条件:曝光时间100ms

详细描述

此实验采用TIRF照明是为了排除溶液中大量悬浮荧光分子的影响,提升所需观察的单分子荧光的信噪比。测试样品为标记了Alexa 488和Alexa 647两个荧光集团的蛋白,所以采用488nm的激光作为激发光光源时,会产生共振能量转移(FRET)使能量从被激发的Alexa 488转移到Alexa 647上,我们在连续的拍摄中可以发现同一个位置Alexa 647发出红色荧光,Alexa 488被激发发出的绿色荧光。实验采用了双色分光器W-View GEMINI,使得实验中可以实时完全同步地监测Alexa 488和Alexa 647所发出绿光和红光的信号;而Flash 4.0的灵敏度以及100ms的曝光时间使得我们可以观察到微观世界里的单分子行为。
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此外,在针对cy3、cy5标记的的样品的测试中,我们还观察到过典型的发生FRET的“交互型”现象——由于分子构象发生变化,Cy3、Cy5的距离改变,Cy3与Cy5的荧光信号也随之变化(如下图)。且随着光漂白,信号整体呈下降趋势。